細(xì)胞學(xué)說(shuō)提出“細(xì)胞是動(dòng)物和植物結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單位”，只有充分了解細(xì)胞的特性與功能，才能深入理解生命現(xiàn)象的深層機(jī)制，才能明晰生物體生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律，才能辨明疾病發(fā)生發(fā)展的原因。單細(xì)胞測(cè)序（single-cell sequencing）在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞的功能和細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)，幫助我們深層次理解生命機(jī)制。
2013-2020?年，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)多次被?Science、Nature?等學(xué)術(shù)期刊評(píng)價(jià)為年度重點(diǎn)技術(shù)，正引領(lǐng)新一輪生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)革命；在腫瘤、神經(jīng)學(xué)、免疫、感染性疾病、生長(zhǎng)發(fā)育和生殖健康等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
提到單細(xì)胞測(cè)序，我們腦中更多浮現(xiàn)得是scRNA-Seq(single-cell RNA -sequencing)；scRNA-seq是目前常用的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，但是逐漸呈現(xiàn)出一些固有的方法學(xué)問(wèn)題：組織類(lèi)型偏好（無(wú)法分析難解離的組織和凍存組織等）；在細(xì)胞懸液制備中會(huì)引入一些轉(zhuǎn)錄偏好；組織解離時(shí)得到易于解離下來(lái)的細(xì)胞，敏感的細(xì)胞可能在解離時(shí)破碎；目前商業(yè)化的單細(xì)胞平臺(tái)都對(duì)細(xì)胞大小有限制等。
snRNA-seq(single-nucleus RNA-sequencing)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到研究者的青睞，逐漸呈現(xiàn)出較為火熱的景象。目前在多種動(dòng)植物組織，如腫瘤組織[1]、腦[7]、腎臟[3]、心臟[8]和脂肪[4]中得到應(yīng)用，在植物單細(xì)胞中也逐漸展現(xiàn)了其優(yōu)勢(shì)[5]。snRNA-seq是否可以和scRNA-Seq一樣，得到一致的結(jié)果，解析生物學(xué)特征，兩者之間有哪些差異，下面幾篇文獻(xiàn)可以略解您的疑慮，帶您初識(shí)snRNA-seq。
scRNA-Seq和?snRNA-seq方法比較文獻(xiàn)解析
1、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.
發(fā)表雜志：Nature Medicine
影響因子：36.13
發(fā)表時(shí)間：2020. 6. 25
實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Chromium
實(shí)驗(yàn)材料：新鮮和凍存的8種腫瘤組織，如NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）， ?NB（成神經(jīng)細(xì)胞瘤），MBC（轉(zhuǎn)移性乳腺癌），GBM（腦膠質(zhì)瘤），CLL（慢性淋巴細(xì)胞白血病），Ovarian（卵巢癌），Melanoma（黑色素瘤）和肉瘤。
研究?jī)?nèi)容：開(kāi)發(fā)了一種系統(tǒng)工具箱，可以分別通過(guò)scRNA-Seq和 ?snRNA-Seq對(duì)新鮮和冷凍的臨床腫瘤樣品進(jìn)行分析；對(duì)同樣的樣品進(jìn)行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析，結(jié)果顯示它們可以得到相同的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種細(xì)胞類(lèi)型的占比不同。
主要結(jié)果：
a.?建立了系統(tǒng)性的scRNA-Seq和snRNA-Seq的實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析流程
研究了8種不同類(lèi)型的腫瘤組織，通過(guò)不同取樣方式，共獲得不同部位共23個(gè)標(biāo)本的40個(gè)樣品的216,490個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞核，這些樣品具有豐富的組織和樣品多樣性；對(duì)不同的細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式，在實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析中對(duì)細(xì)胞/細(xì)胞核質(zhì)量、細(xì)胞/細(xì)胞核回收率、靈敏度、細(xì)胞類(lèi)型和CNV 分析等方面進(jìn)行評(píng)估，確定了實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析流程（圖1-1）；通過(guò)對(duì)8種腫瘤組織實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較，推薦了細(xì)胞和細(xì)胞核分離方式（圖1-2）。
圖1-1 sc/snRNA-Seq 實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析流程
圖1-2 不同腫瘤組織樣品信息和細(xì)胞/細(xì)胞核分離方式
對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤（HTAPP-656）、轉(zhuǎn)移性乳腺癌?(HTAPP-963)、CLL (CLL1) 和 O-PDX (O-PDX1)相同的樣品同時(shí)進(jìn)行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析。兩種方法可以得到相同的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種細(xì)胞類(lèi)型的占比不同；在成神經(jīng)細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，scRNA-Seq獲得更多的免疫細(xì)胞，snRNA-Seq得到更多的惡性腫瘤細(xì)胞（圖1-3）；細(xì)胞檢測(cè)到解離信號(hào)的比例比細(xì)胞核高，且信號(hào)值較高；在細(xì)胞和細(xì)胞核中，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的解離信號(hào)更加明顯（圖1-4）。
圖1-3 scRNA-Seq and snRNA-Seq結(jié)果比較
圖1-4 ?scRNA-Seq and snRNA-Seq解離信號(hào)比較
2.Systematic comparison of single-cell and?single-nucleus RNA-sequencing methods
發(fā)表雜志：Nature biotechnology影響因子：36.558發(fā)表時(shí)間：2020. 4. 6實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-Seq:低通量(Smart-seq2和CEL-Seq2）和高通量(10x Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops和sci-RNA-seq)snRNA-Seq:Smart-seq2、10x Chromium、DroNc-Seq和sci-RNA-seq
scRNA-Seq：人（HEK293）和小鼠（NIH3T3）等比例混合細(xì)胞系和凍存人類(lèi)PBMC（2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）；snRNA-Seq：凍存小鼠大腦皮層（2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）Bulk RNA-Seq：以上3種材料
研究?jī)?nèi)容：選擇2種低通量和5種高通量方法進(jìn)行scRNA-Seq或snRNA-Seq分析；為了直接比較、避免每種方法已有流程的影響，作者開(kāi)發(fā)了一種更加靈活、適用于任何scRNA-Seq的方法“scumi”；通過(guò)比較reads的結(jié)構(gòu)和比對(duì)情況、靈敏度、多胞率和解釋已知的生物學(xué)信息評(píng)估每種方法；兩種低通量方法表現(xiàn)相似，CEL-Seq2受其他細(xì)胞污染reads的影響比較明顯；10x Chromium在高通量方法中表現(xiàn)更優(yōu)。
首先，開(kāi)發(fā)了“scumi”軟件包，從FASTQ文件到產(chǎn)生適用下游分析的基因和細(xì)胞參數(shù)；其次，提出了下游分析前過(guò)濾低質(zhì)量細(xì)胞的方案，這也是數(shù)據(jù)預(yù)處理的重要挑戰(zhàn)，然后對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行相同的reads數(shù)分析；最后，通過(guò)關(guān)鍵的參數(shù)對(duì)每種方法進(jìn)行評(píng)估：①比對(duì)到細(xì)胞核和線(xiàn)粒體基因組的reads 及其結(jié)構(gòu)；②捕獲RNA的靈敏度；③多胞率；④準(zhǔn)確性和重復(fù)性；⑤得到細(xì)胞類(lèi)型中重要的生物學(xué)差異的能力（圖2-1）。
圖2-1 scumi數(shù)據(jù)分析流程
b.?reads結(jié)構(gòu)和比對(duì)到基因組的信息顯示不同方法具有效率差異結(jié)果顯示，不同的方法在預(yù)期的位置沒(méi)有Poly（T）reads比例明顯不同；外顯子、內(nèi)含子、基因間、重疊的差異基因、多重比對(duì)以及無(wú)法比對(duì)的reads不同方法間基本一致；但是細(xì)胞核中內(nèi)含子reads與外顯子reads的比率明顯高于細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞核中有較高比例未剪切的轉(zhuǎn)錄本（圖2-2）。
圖2-2 測(cè)序reads的基因組比對(duì)特征（a. Mixture, b.PBMCs, c.Cortex ）
c.?不同實(shí)驗(yàn)每種方法的靈敏度相對(duì)一致
結(jié)通過(guò)分析每個(gè)細(xì)胞的reads數(shù)、UMIs 和基因數(shù)比較每種方法的靈敏度（即捕獲RNA的能力）；7種方法中，低通量方法靈敏度最高，高通量方法中10x Chromium 每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的UMI和基因數(shù)最多（圖2-3）。
圖2-3不同實(shí)驗(yàn)每種方法的靈敏度比較
d.?不同的方法區(qū)別和獲得細(xì)胞類(lèi)型的能力不同
選擇轉(zhuǎn)錄組分析方法最重要的一項(xiàng)指標(biāo)就是這種方法能否解釋感興趣的生物學(xué)信息。為了更加公平的分析每種方法，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了一致性處理；選擇相同的Reads/cell 和cells/實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞分群和細(xì)胞類(lèi)型鑒定。
在PBMCs中，每種方法都可以獲得豐富的細(xì)胞類(lèi)型，但是每種類(lèi)型的豐度不同，且獲得稀有細(xì)胞類(lèi)型的能力有差異（如漿狀樹(shù)突細(xì)胞）；每種方法都有一定程度的血小板污染。
在大腦皮層中，細(xì)胞核分析得到小鼠大腦皮層多種細(xì)胞類(lèi)型，包括興奮和抑制性神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞,少膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)祖細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞，其中周皮細(xì)胞只在DroNc-Seq Cortex1 中發(fā)現(xiàn)；sci-RNA-seq未得到少突膠質(zhì)祖細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2-4）。
圖2-4不同實(shí)驗(yàn)不同方法細(xì)胞類(lèi)型的比較
3.Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA?Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
發(fā)表期刊：J Am Soc Nephrol
影響因子：9.274
發(fā)表時(shí)間：2019.1
實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：
scRNA-seq ：DropSeq
snRNA-seq：sNuc-DropSeq, DroNc-seq和?10x Chromium
實(shí)驗(yàn)材料：8周大的小鼠腎臟
研究?jī)?nèi)容：
在比較分析中共產(chǎn)生?11,391?個(gè)轉(zhuǎn)錄本。scRNA-seq鑒定了10個(gè)細(xì)胞簇，包括一個(gè)人為解離誘導(dǎo)的壓力相應(yīng)基因群，但是未鑒定到腎小球細(xì)胞。相反，3種snRNA-seq都鑒定到更加多樣性的腎細(xì)胞類(lèi)型，包括腎小球足細(xì)胞，系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，未檢測(cè)到壓力響應(yīng)基因；檢測(cè)到的腎小球足細(xì)胞的比例是已知發(fā)表的scRNA-seq 數(shù)據(jù)的20倍（2.4% versus 0.12%）。更出乎意料的是，snRNA-seq和scRNA-seq 的基因檢測(cè)靈敏度一致。為了驗(yàn)證snRNA-se方法的有效性，分析了經(jīng)過(guò)纖維化和炎癥UUO治療第14天冷凍腎組織，鑒定了罕見(jiàn)近腎小球細(xì)胞，新活化的近端小管和成纖維細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)，以及之前未知的腎小管間質(zhì)信號(hào)通路。
圖3-1?內(nèi)含子對(duì)snRNA-seq?數(shù)據(jù)的影響
b.?snRNA-seq鑒定了3個(gè)特有的細(xì)胞類(lèi)型
將4種方法的數(shù)據(jù)整合分析，共鑒定了13個(gè)細(xì)胞簇，包括足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞；3種snRNA-seq 檢測(cè)足細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和閏細(xì)胞的靈敏度更高；但是scRNA-seq未檢測(cè)到任何足細(xì)胞。差異基因表達(dá)分析顯示，?71.4%?基因在細(xì)胞和細(xì)胞核中都被檢測(cè)到；在檢測(cè)到的基因中，僅僅?5.0%?在細(xì)胞中的表達(dá)量高于細(xì)胞核，6.4%的基因在細(xì)胞核中的表達(dá)量高于細(xì)胞（fold change>1.5，?P value <0.05）（圖3-2）；scRNA-seq高表達(dá)基因包括線(xiàn)粒體、核糖體基因和熱休克途徑中的基因；snRNA-seq高表達(dá)基因包括溶質(zhì)載體、轉(zhuǎn)錄因子和Non-coding?RNA基因。
圖3-2 ??snRNA-seq?和scRNA-seq?差異分析?
?c.??snRNA-seq?分析經(jīng)過(guò)纖維化和炎癥UUO治療的冷凍腎組織
圖3-3 ??snRNA-seq?對(duì)UUO治療冷凍腎組織的分析結(jié)果
snRNA-seq應(yīng)用好文推薦
4. snRNA-seq reveals a subpopulation of?adipocytes that regulates?thermogenesis
發(fā)表信息：Nature；2020.10.28；IF：42.778。
單細(xì)胞平臺(tái)：Smart-Seq2?和10x Chromium
推薦理由:
通過(guò)對(duì)小鼠和人進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的新的細(xì)胞類(lèi)型P4；通過(guò)對(duì)marker基因Cyp2e1和Aldh1a1的深度分析確定P4的主要功能，如免疫熒光染色，基因過(guò)表達(dá)、基因敲除，共表達(dá)等功能驗(yàn)證技術(shù)。證明了這個(gè)亞群通過(guò)醋酸鹽介導(dǎo)的調(diào)節(jié)其產(chǎn)熱能力來(lái)調(diào)節(jié)鄰近脂肪細(xì)胞的活動(dòng)。人類(lèi)脂肪組織中含有較高數(shù)量的該亞群細(xì)胞，這可能解釋了與小鼠脂肪組織相比，人的產(chǎn)熱活性較低的原因，并提示靶向該途徑可用于恢復(fù)產(chǎn)熱活性。
5. The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana?
發(fā)表信息：bioRxiv preprint；doi:?https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156；?2020.07.28
單細(xì)胞平臺(tái)：10x Chromium
推薦理由:
利用原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序困難重重，如原生質(zhì)體獲得困難（不同物種、不同發(fā)育時(shí)期和不同器官細(xì)胞壁成分不同），解離對(duì)基因表達(dá)的影響，原生質(zhì)體細(xì)胞大小超出平臺(tái)的限制等；為了克服原生質(zhì)體的困難，作者進(jìn)行了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析；與已經(jīng)發(fā)表的文章相比，不僅驗(yàn)證了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組可以對(duì)擬南芥根進(jìn)行分析，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了3種新的細(xì)胞類(lèi)型；通過(guò)單細(xì)胞ATAC-Seq和snRNA-Seq?多組學(xué)聯(lián)合分析揭示染色質(zhì)重塑對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響，證明細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記基因也顯示細(xì)胞類(lèi)型特異性的染色質(zhì)可及性模式。我們的數(shù)據(jù)表明，染色質(zhì)的不同重塑是在細(xì)胞類(lèi)型水平上調(diào)控基因活動(dòng)的關(guān)鍵機(jī)制。
結(jié)束語(yǔ)
綜上所述，snRNA-Seq?分析細(xì)胞核內(nèi)的RNA，可以解釋相應(yīng)的生物學(xué)信息；snRNA-Seq?含有較多未剪切的轉(zhuǎn)錄本，包含內(nèi)含子的序列進(jìn)行分析，不僅可以提高提高RNA的捕獲能力，同時(shí)可以得到更多的稀有細(xì)胞類(lèi)型；snRNA-seq解決了scRNA-seq中固有的一些問(wèn)題，能夠獲得更為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
近幾年來(lái)，snRNA-Seq受到越來(lái)越多的青睞，文獻(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)較為迅速；為特殊樣品（如冷凍組織）的單細(xì)胞研究提供新的途徑；為細(xì)胞單細(xì)胞研究開(kāi)辟了新的思路。
snRNA-Seq和scRNA-Seq?是目前解析各種生命現(xiàn)象、揭示各種生物學(xué)機(jī)制的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，各有千秋，研究者需要結(jié)合自身的條件來(lái)確定；如scRNA-Seq在神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活態(tài)（microglial activation）的研究中更勝一籌[6]。我們期待越來(lái)越多的研究者來(lái)解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)這浩瀚的星空，發(fā)現(xiàn)更多耀眼的星。
百邁客引進(jìn)10xGenomics單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，使用Chromium系統(tǒng)采用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)實(shí)現(xiàn)一次性分離、高效標(biāo)記捕獲；同時(shí)具有10x?單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)10x平臺(tái)全面優(yōu)質(zhì)服務(wù)；已經(jīng)具有大量單細(xì)胞分離捕獲，極低量RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增建庫(kù)成功經(jīng)驗(yàn)；提供單細(xì)胞分離捕獲、反轉(zhuǎn)錄建庫(kù)、測(cè)序、標(biāo)準(zhǔn)分析和高級(jí)分析全套單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)；強(qiáng)大的生信團(tuán)隊(duì)不僅提供基本分析，還提供細(xì)胞分化軌跡分析等多種高級(jí)分析；資深單細(xì)胞技術(shù)人員為您提供專(zhuān)業(yè)的課題方案設(shè)計(jì)，為您量身訂造專(zhuān)屬個(gè)性化分析。點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，將可免費(fèi)獲得文章思路設(shè)計(jì)方案。
參考文獻(xiàn)
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